動(dòng)物的認知功能需要通過(guò)對其學(xué)習記憶的情況進(jìn)行評價(jià)，因此需要建立規范的行為學(xué)實(shí)驗方法，從而準確判斷其學(xué)習記憶的情況。根據嚙齒類(lèi)動(dòng)物具有喜歡探索陌生事物的天性，Ennaceur和Delacour于1988年報道了一種非獎賞性的、簡(jiǎn)單的認知記憶實(shí)驗模型———新物體與新位置識別實(shí)驗，用于檢測嚙齒類(lèi)動(dòng)物的記憶能力。該模型根據動(dòng)物對見(jiàn)過(guò)的熟悉物體和沒(méi)有見(jiàn)過(guò)的新物體的探究時(shí)間的長(cháng)短來(lái)評價(jià)被測試動(dòng)物的記憶能力，即當被測試動(dòng)物未遺忘環(huán)境中見(jiàn)過(guò)的熟悉物體時(shí)，便會(huì )用更多的時(shí)間探究沒(méi)有見(jiàn)過(guò)的新物體;當被測試動(dòng)物遺忘了見(jiàn)過(guò)的熟悉物體，則動(dòng)物對環(huán)境中沒(méi)有見(jiàn)過(guò)的新物體和見(jiàn)過(guò)的熟悉物體的探究時(shí)間應基本相同。與其它動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗方法相比，新物體識別實(shí)驗具有不需要外部推動(dòng)力，只需要適當的訓練即可完成，且具有實(shí)驗時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，受到越來(lái)越多的學(xué)者的關(guān)注。但由于新物體識別實(shí)驗缺乏統一的實(shí)驗標準，使其應用受到一定的限制。以往研究針對物體材質(zhì)、時(shí)間間隔等具體檢測條件進(jìn)行，但缺少對行為箱形狀的研究，為了進(jìn)一步規范該方法的實(shí)驗標準，本研究針對新物體實(shí)驗方法中的實(shí)驗行為箱形狀對實(shí)驗結果的影響進(jìn)行考察。
1、材料與方法
1.1實(shí)驗動(dòng)物及飼養環(huán)境
健康ICR小鼠，8周齡，40只，雌雄各半，體質(zhì)量24～26g，購自長(cháng)春億斯實(shí)驗動(dòng)物技術(shù)有限責任公司［實(shí)驗動(dòng)物生產(chǎn)許可證號:SCXK(吉)-2011-0004］。遵照國家實(shí)驗動(dòng)物飼養和使用指南，將小鼠飼養在屏障環(huán)境中，控制溫度在(22±1)℃，12h明暗循環(huán)，自由采食和飲水，預飼期1周。
1.2實(shí)驗儀器
小鼠自主活動(dòng)儀和小鼠新物體識別實(shí)驗箱。
1.3實(shí)驗動(dòng)物分組
ICR小鼠40只隨機分為2組，每組20只，雌雄各半，即方組(n=20)和圓組(n=20)。各組按性別再次隨機分為2組，即方雌組(n=10)、方雄組(n=10)、圓雌組(n=10)和圓雄組(n=10)。
1.4新物體實(shí)驗方法
實(shí)驗前5d，實(shí)驗人員每天將小鼠放到手上撫觸5min，消除小鼠的緊張恐懼感。實(shí)驗前，通過(guò)小鼠自主活動(dòng)儀篩選，剔除活動(dòng)異常的小鼠(活動(dòng)過(guò)少、活動(dòng)過(guò)多、轉圈等)。實(shí)驗當天，先將小鼠放到實(shí)驗室，讓其適應環(huán)境1h，然后進(jìn)行正式實(shí)驗。
新物體識別實(shí)驗包含三個(gè)階段(圖1)。階段1(T1):分別將小鼠單獨放入敞開(kāi)的行為箱(底邊長(cháng)44cm×44cm的方形行為箱或半徑為25cm的圓形行為箱)中，自由探索5min。探索完畢后將小鼠取出，放回飼養籠中。清理行為箱中小鼠的糞尿，75%酒精擦拭，消除異味。本階段在實(shí)驗第yi天上午、下午分別進(jìn)行一次。階段2(T2):分別在行為箱的兩個(gè)相對的區域中放入2個(gè)*相同的物體(物體1和1’)，再次將小鼠放入行為箱中探索5min。每次實(shí)驗結束后，*清理行為箱。本階段實(shí)驗在第er天上午進(jìn)行。階段3(T3):物體1不變(舊物體)，物體1’更換為物體2(新物體)，再次將小鼠放入行為箱中探索5min。每次實(shí)驗結束后，*清理行為箱。本階段實(shí)驗在第er天下午進(jìn)行。所有實(shí)驗均在上午8點(diǎn)至下午5點(diǎn)之間進(jìn)行。
采用SuperMaze動(dòng)物運動(dòng)軌跡跟蹤系統記錄分析T2和T3中小鼠分別探索2個(gè)物體的時(shí)間，其中探索物體1的時(shí)間記為F，探索物體1’或2的時(shí)間記為N，探索兩個(gè)物體的總時(shí)間記為F+N，計算小鼠對物體1’和2的分辨比(discriminationratio，DR)［DR=N/(N+F)×100%］。探索定義為小鼠面朝物體，鼻子與該物體的距離≤2cm。
1．5數據統計分析
采用SPSS21.0forwindows統計軟件包分析。數據用平均值±標準差(x珋±s)表示。采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，兩兩比較采用LSD-t檢驗;組內比較用配對Studentt檢驗。以P＜0.05為差異有統計學(xué)意義。
2、結果
2.1小鼠性別對新物體識別實(shí)驗結果的影響
在T2階段，各行為箱中的實(shí)驗動(dòng)物對物體1和1’的探究時(shí)間:(31.16±16.75)s，(30.97±16.50)s;(30.37±15.95)s，(31.73±15.10)s;(112.33±48.26)s，(112.50±49.76)s;(112.61±47.93)s，
(112.32±47.10)s基本相同(P＞0.05)，在T3階段，各行為箱中的實(shí)驗動(dòng)物對物體2的探索時(shí)間顯著(zhù)長(cháng)于對物體1的探索時(shí)間(P＜0.05)見(jiàn)圖2，但相同形狀的行為箱(方形行為箱，圓形行為箱)中不同性別小鼠對2號新物體的DR無(wú)顯著(zhù)性差異(P＞0.05)
2.2行為箱形狀對新物體識別實(shí)驗結果的影響
在T2階段，不同形狀行為箱中小鼠對兩物體在5min內探索時(shí)間(30.76±15.93)s，(31.35±15.40)s;(112.47±46.81)s，(112.41±47.16)s的差異未達到顯著(zhù)水平(P＞0．05);在T3階段，小鼠對2號物體的探索時(shí)間顯著(zhù)長(cháng)于1號物體，但兩種形狀行為箱中小鼠對新物體的分辨比無(wú)顯著(zhù)差異(P＞0．05)見(jiàn)圖4。T2、T3兩階段中，圓形行為箱中小鼠對兩物體的探索總時(shí)間(224.88±37.05)s，(229.15±33.38)s顯著(zhù)長(cháng)于方形行為箱中小鼠對兩物體的總探索時(shí)間(62.11±23.30)s，(65.58±22.40)s(P＜0.01)
3、討論
新物體識別實(shí)驗是在模仿測試人類(lèi)失憶癥的識別任務(wù)的基礎上發(fā)展起來(lái)的，評價(jià)的是嚙齒動(dòng)物對物體的識別記憶能力。該模型是建立在嚙齒動(dòng)物對新異物體的自發(fā)探索行為的基礎上，且該模型不像迷宮學(xué)習中必須剝奪動(dòng)物飲食或在避免水淹動(dòng)機下進(jìn)行學(xué)習記憶，也不像被動(dòng)回避測試中給予動(dòng)物電擊等負性強化讓動(dòng)物學(xué)習記憶。所以該模型Zui大的優(yōu)點(diǎn)就在于可以讓動(dòng)物在*自然的狀態(tài)下進(jìn)行學(xué)習記憶測試，能夠更好地模擬人類(lèi)和靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物的學(xué)習記憶行為。因此，該模型越來(lái)越多地用在評估藥wu對記憶的作用研究上。
在新物體實(shí)驗方法的使用中，如何規范實(shí)驗流程，建立實(shí)驗動(dòng)物行為學(xué)評價(jià)標準成了實(shí)驗的核心問(wèn)題。本實(shí)驗通過(guò)比較采用不同形狀的行為箱進(jìn)行新物體實(shí)驗時(shí)結果的差異，推斷行為箱形狀對實(shí)驗結果有一定的影響。本實(shí)驗中，T2階段的兩個(gè)物體*相同，且對于小鼠來(lái)說(shuō)均為首ci接觸，因此各組小鼠對物體的DR值均在50%左右，表明實(shí)驗動(dòng)物無(wú)位置偏愛(ài)異常發(fā)生，即實(shí)驗動(dòng)物對兩個(gè)不同位置上的相同物體興趣相同。T3階段，小鼠對2號物體的探索時(shí)間顯著(zhù)長(cháng)于1號物體，說(shuō)明實(shí)驗中選用的新物體引起了小鼠的探索興趣，物體的選擇正確。
各行為箱中，雌雄小鼠對新物體的分辨比無(wú)差異，表明不同性別的實(shí)驗小鼠對新物體的分辨程度相同，即性別不影響對新物體識別實(shí)驗結果。進(jìn)一步的實(shí)驗結果，在T3階段中，不同形狀的行為箱中的實(shí)驗動(dòng)物均能對新物體顯示出積極的探索興趣，分辯比相似，表明行為箱的形狀差異不影響實(shí)驗動(dòng)物對新物體識別行為。但實(shí)驗動(dòng)物在兩種形狀的行為箱中的總探索時(shí)間存在差異，說(shuō)明行為箱的形狀對實(shí)驗動(dòng)物的活動(dòng)程度有一定的影響。這可能是由于方形行為箱的角落效應造成的。
研究結果表明，雖然在兩種不同形狀的行為箱中進(jìn)行的新物體識別實(shí)驗，動(dòng)物對新物體識別結果無(wú)差異，但為了避免角落造成的實(shí)驗動(dòng)物活動(dòng)能力降低現象的發(fā)生，我們認為采用圓形行為箱進(jìn)行新物體識別實(shí)驗能夠更準確地反應實(shí)驗動(dòng)物對新物體的識別能力。
